第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量测定不同样品中基因表达量的相对值

在进行实时荧光定量PCR时，内参基因的选择至关重要，以下是一些选择原则：

• 始终选择表达水平高且均一的基因作为内参基因；
• 避免盲目使用常见的内参基因；
• 常用的内参基因包括GAPDH、Actin和Tublin等。

内参基因的合理选择直接影响结果的有效性。在加入内参基因后，应进行结果的计算。

二、绝对定量

绝对定量是基于标准品，测定样品中基因表达量的绝对值（拷贝数）。常用标准品包括：

• A/克隆质粒；
• B/PCR产物；
• C/cDNA（注意：用于扩增效率测定，但不适用于绝对定量）。

拷贝数的计算基于平均分子量（MW）：

• 双链DNA (dsDNA) = (碱基数) x (660道尔顿/碱基)；
• 单链DNA (ssDNA) = (碱基数) x (330道尔顿/碱基)；
• 单链RNA (ssRNA) = (碱基数) x (340道尔顿/碱基)。

拷贝数计算公式为：

(6.022 x 10²³ 拷贝数/摩尔) x (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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