细胞培养技术概述

在实验室中，细胞培养主要可以分为三种类型：贴壁细胞、悬浮细胞和半贴壁细胞。

细胞类型

(1) 贴壁细胞：这些细胞依附于培养器具（如组织培养塑料）；

(2) 悬浮细胞：这些细胞在生长培养基中自由悬浮，并不附着在培养器具上；

(3) 半贴壁细胞：一些细胞松散地附着在培养器具上，另一些则悬浮于生长培养基中。

细胞增殖特性分类

细胞还可以根据其增殖特性分为有限增殖与无限增殖：
有限增殖：指细胞仅在有限的范围内增殖并保持活力，常见的如原代细胞或经过固定代数传代后停止生长（衰老）的细胞系；
无限增殖：这些细胞具有无限的分裂能力，通常通过转化获得，表现出类似癌症的特征（如失去接触抑制与无限生长）。

本文将着重介绍最常用的细胞类型：贴壁细胞和悬浮细胞。在操作过程中，务必遵循无菌技术和良好的控制方法。

第一阶段：冷冻保存

由于细胞在长期培养中遗传不稳定性逐渐增加，因此，在收到细胞系后应尽快进行冷冻保存。这一过程能确保细胞储存的遗传特征与源材料尽可能接近，同时减少污染风险。冷冻应在添加冷冻保护剂（如DMSO）的情况下，以理想的每分钟1°C的速度进行，以防止细胞内冰晶形成并影响细胞活力。

实验步骤

1. 使用显微镜观察细胞，检查外观并确认无微生物污染，确保细胞处于对数增长阶段，密度大于建议范围，活力应 >90%。
2. 按照标准传代培养方法收集并计数细胞。悬浮细胞的冻存浓度应为每毫升2-5×10⁶个细胞，而贴壁细胞则为1-2×10⁶个细胞。
3. 根据细胞类型选择合适的冷冻保护剂，并根据细胞数量计算所需的冷冻液，进行配置。
4. 以200×g离心细胞悬浮液5分钟，去除上清液，再将细胞沉淀重悬于PBS中。
5. 重离心5分钟，去除上清。
6. 用配置好的冷冻液重悬细胞沉淀，充分混匀后分装于冻存管，并标记相关信息。
7. 将冻存管置于冻存盒中，在-80°C下放置一夜，以控制温度下降。
8. 最后，转移到液氮罐中进行长期保存。

第二阶段：细胞复苏

在需要使用细胞时，应尽快解冻，以减少对细胞活力的不利影响。建议在复苏时通过离心去除冷冻保存剂。

实验步骤

1. 从液氮中取出冷冻管，置于37°C水浴中轻轻晃动，加速解冻，监测至解冻至黄豆大小时取出。
2. 将冻存细胞转移至15ml离心管中含4ml预热培养基，200-250×g离心5分钟。
3. 去除上清，重新用预热培养基重悬细胞沉淀，并在适当密度下接种至培养器具。
4. 根据细胞类型添加所需的生长因子等营养成分。

第三阶段：观察

应定期用显微镜和肉眼检查细胞是否有污染迹象，并观察细胞的整体健康状况，以判断是否需要传代。

实验步骤

1. 用肉眼观察细胞培养状态以排除污染。贴壁细胞应在清澈的培养基中生长，而悬浮细胞的培养基若浑浊度增高，则可能表示污染或密度过高。
2. 通过光学显微镜观察细胞的粘附状态、形态、融合度及密度，确保细胞健康及及时传代。

第四阶段：细胞维持与传代培养

一旦细胞生长健康且达到了目标汇合度，即可进行传代培养。如果未达到目标，需在2-3天后更换培养基并继续培养。

更换培养基

定期更换培养基能防止毒性代谢物的积累，并确保细胞的持续生长。

实验步骤

1. 吸取生长培养基，悬浮细胞先转移至离心管并离心，再去除培养基；贴壁细胞则倾斜培养器具吸出培养基但不完全抽干。
2. 重新添加新鲜的生长培养基，悬浮细胞重悬于新鲜培养基中，贴壁细胞则沿壁添加新鲜培养基。
3. 及时放入培养箱中并持续监测细胞生长及污染情况。

传代培养

若细胞达到了所需的汇合度或密度，应进行传代培养。传代培养是将细胞转移到新培养器具中的过程。

实验步骤

1. 清洗并收集细胞，悬浮细胞在离心后重悬于新鲜培养基；贴壁细胞需先吸除培养基并清洗，再加入消化酶获取细胞。
2. 选择合适的传代比例，将细胞接种至新培养器具中，并添加生长培养基。
3. 在培养器具上标注关键信息，如细胞类型、传代次数、接种密度、日期及操作人。
4. 每日监测细胞生长情况及污染迹象。

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