在实验室中，细胞培养根据细胞类型大致可以分为三类：
（1）贴壁细胞：这些细胞通常粘附在培养容器上（如组织培养塑料）。
（2）悬浮细胞：此类细胞在培养基中悬浮生长，并不附着在培养容器表面。
（3）半贴壁细胞：部分细胞松散贴附在培养容器上，另一些则悬浮于生长培养基中。

另外，细胞还可根据其增殖特性分为有限增殖和无限增殖：
有限增殖指细胞仅能增殖到有限数量，通常是从组织直接分离的原代细胞或在经过一定次数的传代后停止生长的细胞系。
无限增殖则涉及到具有无限分裂能力的细胞，通常这些细胞通过转化获取癌症相似的表型，如失去接触抑制和无限生长能力。

本文重点介绍最常见的细胞类型——贴壁细胞和悬浮细胞。需要注意的是，所有与细胞培养相关的操作必须使用无菌技术和适当的控制方法进行。

第1阶段：冷冻保存

由于细胞在持续培养过程中会累积遗传不稳定性，因此应在收到细胞系后尽快进行冷冻储存，以确保细胞库的遗传特性尽可能接近源材料，并降低污染风险。在冷冻过程中，需在有冷冻保护剂（如DMSO）的情况下，以可控方式冷冻细胞，理想速度为每分钟1°C，以防止细胞内冰晶的形成并保持培养物的活力。

实验步骤：

1. 使用显微镜观察细胞，检查其整体外观，以确保未发生微生物污染。同时，观察细胞是否处于对数生长期，确保细胞密度不超过指导范围，活力大于90%。
2. 按照标准的传代培养方法收集并计数细胞。悬浮细胞密度应为每毫升2-5×10⁶个细胞，贴壁细胞则为每毫升1-2×10⁶个细胞。
3. 根据细胞系的特点选择合适的冷冻保护剂，并计算所需的冷冻液量，依照配方配置冷冻液。
4. 以200×g的速度离心细胞悬液5分钟，去除上清液，再将细胞沉淀重悬于PBS中。
5. 再次以200×g离心5分钟，去除上清液。
6. 使用准备好的冷冻液重悬细胞沉淀，充分混匀后，转移至合适的冻存管中，标记重要信息，包括日期、细胞名称、编号、传代数等。
7. 将冻存管放入冻存盒，置于-80°C的环境中过夜以控制温度下降。
8. 最后，将细胞转移至液氮罐中进行长期储存。

第2阶段：细胞复苏

在需要使用细胞时，应尽快解冻，以降低对细胞活力的不利影响。推荐在复苏时通过离心去除冷冻保存剂。

实验步骤：

1. 从液氮中取出冷冻管，放置于37°C的水浴中轻轻晃动，加速解冻。当冷冻管内的细胞解冻至黄豆大小时，取出。
2. 将1ml细胞转移至含有4ml预热培养基的15ml离心管中，以200-250×g的速度离心5分钟。
3. 去除上清液，用适量预热培养基重悬细胞沉淀，选择合适的接种密度，接种至相应的培养容器中。
4. 根据细胞类型必要，添加相应的生长因子等成分。

第3阶段：观察

应定期用显微镜和肉眼观察细胞是否存在微生物污染，并检查细胞的健康状况决定是否需要传代培养。

实验步骤：

1. 用肉眼观察细胞培养状态，排除污染。对于贴壁细胞，生长培养基应清澈，若出现浑浊则可能是污染迹象。悬浮细胞的培养基因细胞悬浮而变得浑浊，过于浑浊可能表示污染或者细胞密度过高。
2. 通过光学显微镜观察细胞生长情况，包括细胞是否贴壁、形态是否符合预期、融合度和细胞密度等。如果发现细胞形态异常，可能是污染或分化的迹象。
3. 定期检查细胞，以确保没有支原体污染的存在，并在培养过程中监测细胞的细菌、真菌和酵母污染的迹象。

第4阶段：细胞维持和传代培养

若细胞生长健康且达到了所需的汇合度，可进行传代培养或接种细胞供实验使用。如果细胞尚未达到汇合度，请定期更换培养基，直至达到预期状态。如发现细胞污染迹象，需及时弃用。

更换培养基：

在培养细胞时，需定期更换培养基以防止毒性代谢物（如乳酸）的积累，并确保生长培养基成分的持续供应。培养基的pH值变化可以通过酚红等指示剂监测，以决定换液的合适时机。

实验步骤：

1. 吸取生长培养基。对于悬浮细胞，首先转移培养物至离心管，离心去除培养基。对于贴壁细胞，微倾培养容器，直接吸出培养基，注意不完全吸干。
2. 重新添加新鲜的生长培养基。对于悬浮细胞，将新鲜培养基重悬细胞沉淀，混匀后转移至新容器；对于贴壁细胞，直接在壁面添加新鲜培养基。
3. 快速将培养容器放入培养箱，继续监测细胞生长及污染情况。

传代培养：

当细胞生长到所需汇合度后，应进行传代培养，将细胞从旧容器转移至新容器，加入新鲜培养基继续生长。

实验步骤：

1. 清洗并收集细胞。对于悬浮细胞，转移至离心管，去除培养基并将细胞沉淀重悬在PBS中；对于贴壁细胞，则需先洗涤，再用消化酶处理，最后将细胞悬浮在新鲜培养基中。
2. 选择合适的稀释比例，将适量细胞接种至新的培养容器，并添加新鲜培养基。
3. 在培养容器上标记关键信息，包括细胞类型、传代次数、接种密度、日期和操作人员等，并进行必要的孵育。
4. 继续每天监测细胞的生长和污染迹象。

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